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Jul 30, 2023

Durch Metagenomik vorhergesagte Vitamin-Interdependenzen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4768 (2023) Diesen Artikel zitieren 1 Details zu altmetrischen Metriken Metagenomische oder Metabarcoding-Daten werden häufig verwendet, um mikrobielle Interaktionen in komplexen Zusammenhängen vorherzusagen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4768 (2023) Diesen Artikel zitieren

1 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Metagenomische oder Metabarcoding-Daten werden häufig verwendet, um mikrobielle Interaktionen in komplexen Gemeinschaften vorherzusagen, diese Vorhersagen werden jedoch selten experimentell untersucht. Hier verwenden wir ein Korrelationsnetzwerk zur Organismenhäufigkeit, um Faktoren zu untersuchen, die die Gemeinschaftsorganisation in aus Minenrückständen stammenden mikrobiellen Laborkonsortien steuern, die unter Dutzenden von Bedingungen gezüchtet wurden. Das Netzwerk wird mit metagenomischen Informationen über funktionelle Kapazitäten überlagert, um überprüfbare Hypothesen zu generieren. Wir entwickeln eine Metrik, um die Bedeutung jedes Knotens innerhalb seiner lokalen Netzwerkumgebung im Verhältnis zu korrelierten Vitamin-Auxotrophen vorherzusagen, und sagen voraus, dass eine Variovorax-Art ein Knotenpunkt als wichtige Thiaminquelle ist. Die Quantifizierung von Thiamin während des Wachstums von Variovorax in Minimalmedien zeigt eine hohe Thiaminproduktion von bis zu 100 mg/L. Man geht davon aus, dass einige der korrelierten Thiamin-Auxotrophen Pantothenat produzieren, das, wie wir zeigen, für das Wachstum von Variovorax erforderlich ist, was bestätigt, dass eine Untergruppe der Vitamin-abhängigen Wechselwirkungen gegenseitig ist. Eine Cryptococcus-Hefe produziert das B-Vitamin Pantothenat und die Co-Kultivierung mit Variovorax führt zu einer 90- bis 130-fachen Fitnesssteigerung beider Organismen. Unsere Studie zeigt die Vorhersagekraft von Metagenom-informierten, mikrobiellen Konsortien-basierten Netzwerkanalysen zur Identifizierung mikrobieller Interaktionen, die der Struktur und Funktionsweise mikrobieller Gemeinschaften zugrunde liegen.

Mikrobielle Gemeinschaften sind von entscheidender Bedeutung für die menschliche Gesundheit, die Landwirtschaft, industrielle Bioprozesse und das Funktionieren natürlicher Umgebungen wie Boden, Grundwasser und Ozeane. Es mangelt uns jedoch an der Fähigkeit, die Strukturen mikrobieller Gemeinschaften und deren mögliche Veränderung durch Störungen wie anhaltende Umweltveränderungen vorherzusagen. Mikrobielle Gemeinschaften basieren auf zahlreichen Wechselwirkungen, deren Verständnis unsere Fähigkeit verbessern sollte, die Funktion des Mikrobioms zu manipulieren und zu verbessern.

Die korrelationsbasierte Netzwerkanalyse ist eine der ältesten Methoden zur Identifizierung interagierender Organismen in Ökosystemen1. Im Kontext mikrobieller Gemeinschaften wurden solche Netzwerke und Interaktionen im Großen und Ganzen anhand von Häufigkeit und taxonomischen Informationen vorhergesagt, die aus 16 S-rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten abgeleitet wurden (wie von Matchado et al.2 und Banerjee et al.3 überprüft). Allerdings liefert die 16 S-rRNA-Sequenzierung keine Informationen über das funktionelle Potenzial eines Organismus und leidet außerdem unter der Tatsache, dass die Netzwerkknoten, die die quantifizierbaren Einheiten der 16 S-Analyse darstellen (Amplikonsequenzvarianten oder operative taxonomische Einheiten), nicht unbedingt gleichbedeutend mit unabhängigen mikrobiellen Einheiten sind Spezies. Aus 16 S-Daten erstellte Netzwerke stellen daher wahrscheinlich kein gemeinsames Vorkommen einzigartiger und unabhängiger Arten dar und es fehlt ihnen jegliche funktionale Grundlage, um zu erklären, warum einige Organismen Netzwerkknotenpunkte sind oder starke gegenseitige Abhängigkeiten mit anderen Organismen aufweisen.

Um ein mechanistisches Verständnis der Interaktionen in Gemeinschaften zu generieren, schlugen Qian et al.4 kürzlich vor, von korrelationsbasierten Netzwerken zu Modellierungsansätzen überzugehen. Dazu gehören verallgemeinerte Lotka-Voltrerra-Modelle5 und Dynamic-Flux-Balance-Analysemodelle6, die auf genomischen Informationen basieren. Beispielsweise wurden genomische Informationen verwendet, um Stoffwechselmodelle zu erstellen, die die Wechselwirkungen zwischen zwei Arten in Kokulturen vorhersagen7 und haben gezeigt, dass Kreuzfütterung häufig vorkommt. Die inhärente Natur der Kreuzernährung zwischen Organismen, die nicht für die Biosynthese ihrer eigenen, für das Wachstum notwendigen Metaboliten kodieren, führte zur Entstehung der Black-Queen-Hypothese8. Diese Hypothese geht davon aus, dass der Verlust von Genen und Signalwegen die Schonung der Ressourcen eines Organismus ermöglicht und zu mikrobiellen Abhängigkeiten führt.

Trotz der Fortschritte und der vielversprechenden Aussichten dieser Modellierungsansätze sind sie für komplexe mikrobielle Gemeinschaften unter unterschiedlichen Bedingungen nach wie vor schwierig umzusetzen und daher weitgehend auf einfache mikrobielle Systeme beschränkt. Im Gegensatz dazu stellten wir die Hypothese auf, dass die funktionellen Grundlagen mikrobieller Interaktionen vorhergesagt werden können, wenn genomaufgelöste metagenomische Daten für komplexe mikrobielle Gemeinschaften in herkömmliche Netzwerkanalysen einbezogen werden.

Unsere bisherige Arbeit hat Metagenom-Datensätze aus zahlreichen Bioreaktoren erstellt und analysiert, die mit einer Thiocyanat-abbauenden (SCN-)Mikrobenkultur aus einem Minenrückstandsreservoir beimpft und unter unterschiedlichen Bedingungen betrieben wurden9,10,11,12. Da Vitamin B12 (Cobalamin) nur von einer Untergruppe von Organismen in diesen Systemen produziert wird12, nehmen wir an, dass die Vitaminproduktion der Funktion bestimmter Schlüsselorganismen in diesen Gemeinschaften zugrunde liegen könnte. Vitamine sind für die Zellfunktion unerlässlich und Vitamin-Auxotrophe werden häufig in mikrobiellen Gemeinschaften beobachtet13,14. Nicht alle Bakterien benötigen bestimmte Vitamine. Ein Vitamin-Auxotroph wird daher als ein Organismus definiert, der (i) nicht in der Lage ist, sein eigenes Vitamin (ii) zu synthetisieren, das er für sein Wachstum benötigt. Allerdings sagten Xavier et al.15 voraus, dass einige Vitamine und Cofaktoren in Bakterien essentiell sind, darunter Thiamin, Coenzym A (für dessen Biosynthese Pantothensäure benötigt wird) und NAD(H). Sokolovskaya et al.14 schlugen Cobamide als Modellsystem für die Untersuchung mikrobieller Wechselwirkungen vor, teilweise weil ihre Biosynthesewege gut kommentiert und nahezu essenziell sind. Experimentelle Beweise stützen diesen Fokus. Beispielsweise wurden in einer früheren Studie Vitamin-, Aminosäure-, Nukleotid- und Kohlenstoffstoffwechsel-Auxotrophe in E. coli erzeugt und festgestellt, dass Vitamin-Auxotrophe eher in Wechselwirkungen mit Organismen mit komplementären Auxotrophen in gemischten Gemeinschaften eintreten16.

In dieser Studie haben wir ein korrelationsbasiertes Netzwerk für in Bioreaktoren gezüchtete mikrobielle Gemeinschaften aufgebaut, indem wir zuvor veröffentlichte Thiocyanat-Bioreaktor-Metagenom-Datensätze verwendet und diesem Netzwerk funktionelle Informationen überlagert haben, wobei wir uns speziell auf die Vitaminbiosynthese konzentrierten. Mit unserem Ansatz identifizierten wir Organismen, die Knotenpunkte im Korrelationsnetzwerk sind, darunter einen, von dem vorhergesagt wird, dass er Thiamin an korrelierte Thiamin-Auxotrophe liefert. Wir haben diese Vorhersage getestet, indem wir diesen vorhergesagten Thiaminproduzenten und Thiamin-Auxotrophe isoliert und Co-Kulturexperimente durchgeführt haben, in denen die Menge des produzierten Thiamins quantifiziert wurde. Wir schlagen vor, dass die Überlagerung von genomaufgelösten metagenomischen Funktionsinformationen auf Netzwerkanalysen die metabolischen Wechselwirkungen, die innerhalb von Subnetzwerken mikrobieller Gemeinschaften auftreten, allgemeiner erklären können.

Diese Studie nutzte Zeitreihen und genomaufgelöste metagenomische Datensätze, die aus Bioreaktoren erfasst wurden, die mit einem mikrobiellen Konsortium geimpft wurden, das aus einer einzelnen Umweltgemeinschaft stammte, die von einer Minenrückstandsstelle beprobt wurde, und die unter einer Reihe von Bedingungen betrieben wurden, einschließlich variierender Thiocyanat (SCN). Konzentrationen, angewendete hydraulische Verweilzeiten und mit oder ohne Zugabe von Melasse als zusätzliche Energiequelle9,10,11,12. Bei diesen Reaktorstudien wurden bestimmte Betriebsbedingungen konstant gehalten, während andere variiert wurden. Die Reaktoren selbst waren identisch, wurden alle auf Raumtemperatur gehalten und in allen Experimenten wurde die gleiche Grundmedienzusammensetzung verwendet. Allerdings wurden in diesen Studien der Melasseeinbau, die Thiocyanatkonzentration und die Verdünnungsrate variiert.

Da sich in den Bioreaktoren Organismen befanden, die in der Lage waren, Thiocyanat abzubauen, blieben die Thiocyanatkonzentrationen unter den Nachweisgrenzen, wodurch toxische Auswirkungen verhindert wurden. Die 92 metagenomischen Datensätze enthielten Entwurfsgenome für praktisch alle relativ häufig vorkommenden Organismen. Wir haben diese Daten verwendet, um ein auf Abundanz basierendes Netzwerk für gleichzeitiges Vorkommen zu konstruieren, auf das wir Vorhersagen zur Funktionskapazität und Vitamin-Auxotrophen überlagerten und diese vorhergesagten mikrobiellen Wechselwirkungen identifizierten und testeten (Abb. 1).

Zunächst werden Metagenom-assoziierte Genome gewonnen und für die abundanzbasierte Korrelationsnetzwerkanalyse verwendet (a, b). Funktionelle Merkmale wie die Vitaminbiosynthese werden aus den Genomen abgeleitet und dem Netzwerk überlagert (c). Die Bedeutung von Knoten mit einer bestimmten funktionalen Annotation wird geschätzt (d; siehe Methoden für eine detaillierte Erklärung dieser Gleichung). Die generierte Metrik schätzt die Bedeutung eines Vitamin produzierenden Organismus für die Versorgung anderer Mitglieder in der lokalen Netzwerknachbarschaft mit diesem Vitamin. Dies führt zur Generierung von Hypothesen, die mögliche mikrobielle Interaktionen beschreiben (e).

Wir haben eine Korrelationsanalyse mit Fastspar17 durchgeführt, das den SparCC-Algorithmus18 implementiert, der entwickelt wurde, um die mit Kompositionsdaten verbundenen Herausforderungen zu bewältigen. Wir verwendeten positive lineare Korrelationen zwischen den 309 artenrepräsentativen Genomen, die in den 92 Bioreaktor-Metagenomen gewonnen wurden (Abb. 2a, siehe Methodik). Organismen mit starken positiven Korrelationen wurden in das Korrelationsnetzwerk aufgenommen. Dieses Netzwerk verfügt über 120 Knoten, die unabhängige mikrobielle Arten repräsentieren, mit durchschnittlich vier Nachbarn pro Knoten. Die gesamte Netzwerkdichte betrug nur 6,7 % (der Prozentsatz aller möglichen Kanten zwischen den Knoten in einem Netzwerk), was darauf hindeutet, dass das Netzwerk spärlich war (ein niedriges Konnektivitätsniveau aufweist). Eine Netzwerkdichte von 100 % würde einem Netzwerk entsprechen, in dem jeder Knoten mit jedem anderen Knoten verbunden ist. Das Netzwerk hatte eine Modularität von 0,52 (ein Maß zwischen 0 und 1, das die Aufteilung von Knoten innerhalb eines Netzwerks in miteinander verbundene Gruppen quantifiziert). Diese relativ hohe Modularität weist auf eine weitgehende Trennung von Organismengruppen in Teilnetzwerke und möglicherweise auf unterschiedliche Gemeinschaften hin19,20.

Eine Netzwerkanalyse basierend auf der sparCC-Korrelation über 92 Metagenome hinweg wurde verwendet, um Assoziationen von Mikroorganismen mit anderen Mitgliedern vorherzusagen. Die Knoten mit der größten Betweenness-Zentralität wurden als Netzwerk-Hubs abgegrenzt und nummeriert. Vier dieser Netzwerkknoten (b) kodieren Gene für die Biosynthese von Thiamin (Vitamin B1). Von diesen vier Hubs (c) weist Variovorax (Knoten) 55 die größte Bedeutung für korrelierte auxotrophe Mitglieder auf, basierend auf Thiamin-Hubness-Metriken, die den Grad, Verbindungen zu B1-defizienten Knoten und die Anzahl der Verbindungen berücksichtigen, die diese B1-defizienten Knoten haben müssen B1-Produzenten. d Verteilung der berechneten Vitamin-Hub-Metrikwerte von Variovorax (Knoten 55) anhand des in a gezeigten Netzwerks, nachdem 38 Knoten innerhalb des Netzwerks zufällig die Kapazität zur Produktion von Thiamin zugewiesen wurden, über 1000 Simulationen. Variovorax kommt in Gemeinschaften mit vielen anderen Bakterien vor, die Thiamin produzieren können, korreliert jedoch fast ausschließlich mit Thiamin-Auxotrophen innerhalb von Bioreaktorgemeinschaften. Als Beispiel für dieses Phänomen ist die Ranghäufigkeitskurve der relativen Häufigkeit der 44 am häufigsten vorkommenden Mikroorganismen in der Bioreaktorprobe SCN18_30_10_14_R1_P dargestellt.

Wir haben acht Knoten als Netzwerk-Hubs abgegrenzt (Abb. 1a), basierend auf erhöhter Betweenness-Zentralität, einer Metrik für das gesamte Netzwerk, die die relative Bedeutung eines Knotens für die Gesamtkonnektivität innerhalb eines Netzwerks darstellt. Die Zentren waren drei Alphaproteobakterien (ein Mesorhizobium sp., ein Sphingomondales sp. und ein Rhodospirillales sp.), drei Betaproteobakterien (Variovorax, Commamonas, Nitrospira), ein Mitglied der Gammaproteobakterien-Familie Rhodanobaceraceae und ein Mitglied der Bacteroidiota-Familie Chitinophagaceae.

Das Netzwerk wurde in Module unterteilt, Teilnetzwerke, aus denen das Netzwerk besteht, indem die maximale Modularität des Netzwerks auf der Grundlage der Louvain-Heuristik berechnet wurde (Abb. S1). Modulare Netzwerke wie dieses weisen innerhalb dieser Module eine größere Anzahl von Kanten auf als bei anderen Modulen. Vier der Module verfügen über einen einzigen Hub-Organismus, zwei haben keinen Hub-Organismus und zwei enthalten zwei Hub-Organismen.

Wir haben untersucht, wie sich bestimmte Bedingungen auf die Netzwerkstruktur auswirken können. Wir haben die Proben in Biofilm oder Plankton sowie in Umgebungen mit hohen oder niedrigen Thiocyanatkonzentrationen eingeteilt. Die meisten Netzwerkknotenpunkte zeigten eine ähnliche Häufigkeit und Häufigkeit in Biofilm- und Planktonproben (Abb. S2, S3). Die Chitinophagacaea (Knoten 221) war jedoch in Planktongemeinschaften sowie in Proben mit hohem Thiocyanatgehalt häufiger und häufiger anzutreffen. Dies galt auch für die anderen Knoten im Modul dieses Knotens. Im Gegensatz dazu war das mit dem Alphaproteobacteria-Hub (Knoten 54) verbundene Modul in Proben mit niedrigem Thiocyanatgehalt und in Planktongemeinschaften häufiger und häufiger anzutreffen. Die anderen ermittelten Hub-Knoten zeigten kaum Unterschiede zwischen diesen Bedingungen, was darauf hindeutet, dass sie innerhalb dieser Bioreaktorsysteme eine breitere ökologische Toleranz aufweisen.

Wir haben die mögliche Bedeutung von Vitaminproduzenten innerhalb ihrer lokalen Netzwerknachbarschaft quantifiziert (Abb. 2b), indem wir eine Vitamin-Hubness-Metrik auf Knotenebene definiert haben. Die Metrik berechnet das Produkt aus dem Grad eines Knotens (Anzahl der Korrelationen) und seiner Anzahl von Korrelationen mit Vitamin-Auxotrophen, relativ zur durchschnittlichen Anzahl der Verbindungen, die diese Auxotrophen mit Vitaminproduzenten haben. Dadurch werden gut vernetzte Vitaminproduzenten identifiziert, die mit vielen Auxotrophen korrelieren. Der zweite Term verringert die Punktzahl der Produzenten, deren Auxotrophe mit anderen Produzenten korreliert sind, von denen sie das gewünschte Vitamin beziehen könnten. Mithilfe dieses Ansatzes haben wir mehrere Organismen identifiziert, die möglicherweise für die Bereitstellung von B-Vitaminen wichtig sind. Dazu gehörten die Huborganismen Nitrospira (Knoten 176), Comamonas (Knoten 261) und Variovorax (Knoten 55) für die Bereitstellung von Thiamin, Chitinophagacaea (Knoten 221) für Pantothenat sowie ein Rhodanobacter (Knoten 48) für die mögliche Bereitstellung von Biotin und Riboflavin (Abb. S4, S5). Es ist erwähnenswert, dass die in der Analyse verwendeten Messwerte nicht darauf hinweisen, dass die identifizierten Organismen die einzigen in ihren Gemeinschaften sind, die in der Lage sind, die spezifischen Vitamine zu produzieren. Stattdessen geht es darum, potenzielle Vitaminproduzenten zu identifizieren, auf die sich Auxotrophe in der Gemeinschaft bei der Bereitstellung dieser Vitamine verlassen können.

Wir haben eine Isolationskampagne durchgeführt, um so viele im Netzwerk vertretene Organismen wie möglich wiederherzustellen. Dies führte zur Isolierung von 43 Bakterienarten und einzelnen Hefearten. Es wurde nur ein Hub-Organismus isoliert, ein Variovorax entsprechend Knoten 55. Die Genomsequenz des Isolats entsprach (99,99 % ANI) dem Genom aus dem Metagenom für den Hub-Organismus. Wir haben uns daher auf das Subnetzwerk konzentriert, für das Variovorax der Hub ist.

Wir wollten herausfinden, ob der Grund für den hohen Thiamin-Hubness von Variovorax von 60,0 (Abb. 2c) in der Anreicherung von Thiamin-Auxotrophen in der lokalen Netzwerkumgebung oder in der Abwesenheit anderer Thiamin-Produzenten außer Variovorax oder in einer Kombination davon liegt beide. Wir haben 38 Knoten nach dem Zufallsprinzip als Produzenten identifiziert (die tatsächliche Anzahl der Knoten, von denen festgestellt wurde, dass sie zur Thiaminproduktion in der Lage sind) und 82 als Auxotrophe mit der Fähigkeit zur Thiaminproduktion und haben den Thiamin-Hubness-Score von Variovorax neu berechnet. Wir haben diesen Vorgang für insgesamt tausend Simulationen wiederholt (Abb. 2d). Die Verteilung dieser Werte ähnelt einer Normalverteilung mit einem durchschnittlichen Wert von 48,2 und einer Standardabweichung von 7,9, was bedeutet, dass der Variovorax-Thiamin-Hubness-Wert von 60,0 nur etwa 1,5 Standardabweichungen über dem Mittelwert lag. Daher ist der hohe Thiamingehalt von Variovorax nicht auf die Anreicherung von Auxotrophen in seiner lokalen Netzwerkumgebung zurückzuführen, sondern darauf, dass Variovorax einer der wenigen Thiaminproduzenten ist, mit denen die Thiamin-Auxotrophe korrelieren.

Variovorax kam in Gemeinschaften mit vielen anderen vorhergesagten Thiamin (Vitamin B1)-Produzenten vor, aber die Mehrheit der mit Variovorax korrelierten Organismen waren Thiamin-Auxotrophe (Abb. 2e). Interessanterweise enthielt jedes Modul mindestens ein Metagenom-assembliertes Genom (MAG) mit einem vollständigen Weg für die Biosynthese von Thiamin; Die meisten waren Alphaproteobakterien oder Betaproteobakterien (Ergänzungsdaten 1, Ergänzungsdaten 2, Abb. S6). Wir fanden heraus, dass 99 % der 309 in dieser Studie analysierten Genome Enzyme des TCA-Zyklus kodierten, wie in Abb. S6 dargestellt. Eine Ausnahme bildeten jedoch drei Saccharibacteria-Genome, da sie für diese Gene und Metaboliten auf ihren Wirt angewiesen sind21. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass jedes Genom, einschließlich der Saccharibakterien, mindestens zwei und im Mittel sieben Enzyme enthielt, die Thiamin als Cofaktor benötigen22 (Abb. S6). Es wurde vorhergesagt, dass viele Mitglieder der Gemeinden, in denen Variovorax vorkam, auch Thiamin produzieren würden (Abb. 2e). Dies wirft die Frage auf, warum Varivorax und nicht ein anderer Thiaminproduzent als Huborganismus fungiert.

Wir haben Flashweave19 eingesetzt, um die Möglichkeit zu untersuchen, den vorhergesagten Variovorax-Phänotyp mithilfe einer alternativen Korrelationsmethode zu erkennen (Abb. S7). Das resultierende Netzwerk wies im Vergleich zu SparCC (Fastspar) eine höhere Anzahl vorhergesagter Korrelationen auf und zeigte modulare Eigenschaften, bestehend aus sechs Submodulen mit einem Modularitätswert von 0,497. Von den 164 Genomen in diesem Netzwerk wurde vorhergesagt, dass 49 in der Lage seien, Thiamin zu produzieren. Wir haben die Thiamin-Hub-Metrik für diese Knoten berechnet und festgestellt, dass die Mehrheit der Knoten mit der höchsten Bewertung in diesem Netzwerk mit den Knoten mit der höchsten Bewertung im SparCC-Netzwerk übereinstimmt. Dazu gehörten die Comamonas (Knoten 261), Bradyrhizobiaceae (Knoten 233), Nitrospira (Knoten 176) und vor allem Variovorax (Knoten 55). Interessanterweise hatte der Commamonas (Knoten 261), der voraussichtlich ein Netzwerk-Hub des SparCC-Netzwerks sein sollte, die höchste Betweenness-Zentralität aller Knoten im Fastweave-Netzwerk.

Ein einzelnes Thiamin-Pyrophosphat (TPP)-Riboschalter-reguliertes Operon enthält den Großteil der bekannten Thiamin-Biosynthesegene im Variovorax-Genom. In diesem Operon sind eine Thiaminpermease und ein TonB-abhängiges rezeptorähnliches Protein enthalten, von dem vorhergesagt wird, dass es sich um einen aktiven Thiamintransporter handelt (Abb. 3a). Zu den biosynthetischen Genen gehören das thiD, dessen Produkt für die Phosphorylierung der Pyrimidineinheit verantwortlich ist, mehrere Gene, die an der Biosynthese des Thiazolrings beteiligt sind, und thiE, das für die Verknüpfung dieser beiden Einheiten verantwortlich ist. Das thiC-Gen, das für die Phosphomethylpyrimidinsynthase kodiert, die für die Erzeugung von Hydroxymethylpyrimidin verantwortlich ist, befindet sich in einem separaten TPP-Riboschalter-regulierten Operon. Die übrigen Gene, die an der Thiamin-Biosynthese beteiligt sind (Gene iscS, thiL, dxs), sind separat im Variovorax-Genom lokalisiert. Weder die Standard-Thiamin-Transporter-Gene thiT (auch als yuaJ bezeichnet) noch eines der ykoFEDC-Gene wurden im Variovorax-Genom identifiziert, möglicherweise aufgrund einer schlechten Transporter-Annotation.

ein schematisches Diagramm der Thiamin-Biosyntheseoperons, die durch TPP-Riboschalter im isolierten Variovorax-Genom reguliert werden, und ein (b) Zelldiagramm, das das genetische Potenzial des aus der Bioreaktorgemeinschaft isolierten Variovorax darstellt.

Fehlregulierte Thiamin-Operon-Mutanten wurden entwickelt, um die Thiaminproduktion für biotechnologische Anwendungen zu steigern23. Dies erfordert die Mutation von drei Genen, darunter die Thiamin-Monophosphat-Kinase (thiL). Die isolierte thiL-Aminosäuresequenz von Variovorax scheint funktionsfähig zu sein, basierend auf einem Vergleich mit einer funktionellen thiL-Sequenzanalyse von McCulloch et al.24. Die Reste des aktiven Zentrums unseres thiL von Variovorax sind vorhanden und die zusätzlichen konservierten Reste, die von McCulloch und Co-Autoren identifiziert wurden, wurden weitgehend beibehalten (Ergänzende Daten 2).

Man geht davon aus, dass das 7,9 Mbp große Variovorax-Genom für einen äußerst vielseitigen aeroben Stoffwechsel kodiert, mit der Fähigkeit, eine Vielzahl von Zuckern (einschließlich Trehalose und Stärke), Lipiden sowie komplexen und widerspenstigen (oft pflanzlichen) Kohlenstoffverbindungen wie Xylan und Xylan zu nutzen Zellulose (Abb. 3b). Das Genom kodiert auch für die Biosynthese von Thiamin, dem Siderophor Serobactin und Fettsäuren sowie für eine große Anzahl von Genen im Zusammenhang mit Motilität und Chemotaxis. Dem Genom fehlt jedoch ein vollständiger Weg für die Biosynthese von Pantothenat (Vitamin B5). Das Variovorax-Isolat wuchs aerob auf Zucker, Pyruvat und verzweigtkettigen Aminosäuren, das Wachstum erforderte jedoch die Zugabe von Pantothenatsäure (Vitamin B5). Es wurde festgestellt, dass Variovorax mit zwei Pantothenatsäure produzierenden Bakterien, einem Sphingobakterium und einem Kapabakterium, korreliert.

Eine Reihe von mit Variovorax korrelierten Bakterien gehören zu seltenen und wenig erforschten Phyla, darunter ein Chloroflexota, ein Kapabacteria, ein Armaimondota und zwei Saccharibacteria (Abb. 4a). Wie andere Saccharibakterien verfügen auch die Saccharibakterien über kleine Genome und stark reduzierte Stoffwechselkapazitäten. Der Wirt der Saccharibakterien (Knoten 45) wurde zuvor aufgrund von Koexistenzmustern, die durch hierarchische Clusterbildung identifiziert wurden, als Mikrobakterium ginsengsoli (Knoten 144) vorhergesagt12. Weder Saccharibacteria noch Microbacterium verfügen über Genome, die für die Biosynthese von Thiamin kodieren, dennoch kodieren alle mehrere Gene, die für Proteine ​​kodieren, von denen bekannt ist, dass sie Thiamin als Cofaktor benötigen. Die starke Vermehrung von Saccharibakterien erfolgte nur, wenn Variovorax einigermaßen reichlich vorhanden war (Abb. S8B). Dies legt nahe, dass Saccharibakterien sowohl vom Wirts-Mikrobakterium als auch von Variovorax abhängig sind.

Mikrobakterium (Knoten 144) und Saccharibakterium verfügen beide über mehrere Gene, die Proteine ​​kodieren, die Thiamin als Cofaktor benötigen – keines dieser Genome kodiert für die Thiamin-Biosynthese. Eine Version dieser Abbildung mit klarerer Knotentrennung finden Sie im Zusatzmaterial (Abb. S8).

Variovorax gilt aufgrund seiner Fähigkeit, komplexe Kohlenstoffverbindungen abzubauen, als wichtiger Knotenpunkt in Rhizosphärengemeinschaften. Die Ergebnisse dieser Studie legen jedoch die Möglichkeit nahe, dass auch die Vitaminproduktion zu seinem Knotenverhalten beiträgt. Daher untersuchten wir, ob die Thiaminproduktion ein gemeinsames Merkmal innerhalb der Gattung Variovorax ist. Wir haben alle Proteobakteriengenome in der Genome Taxonomy Database (GTDB) auf ihre Fähigkeit zur Thiaminproduktion untersucht. Die Fähigkeit zur Thiaminsynthese wurde bei 24,5 % der Gammaproteobacteria-Gattungen, 20 % der Proteobacteria-Gattungen und nur 10 % aller 9884 Proteobacteria-Genome beobachtet. Variovorax gehört zu den Proteobacteria-Gattungen mit dem höchsten Anteil an Mitgliedern, die die Thiamin-Biosynthese kodieren (Abb. 5b). Die Biosynthese von Thiamin ist auch in Genomen der Kategorien Shewanella und Pseudomonas häufig. Mitglieder der Gattungen Rhizobium, Mesorhizobium und Sphingomonas scheinen jedoch selten für die Thiamin-Biosynthese zu kodieren.

ein phylogenetischer Baum aus 16 verketteten ribosomalen Proteinen aus 70 Variovorax-Genomen, der zusammen mit dem aus unserem Bioreaktor isolierten Variovorax in der Genome Taxonomy Database (GTDB) hinterlegt ist. Die Kodierung eines vollständigen Vitamin-B1-Biosynthesewegs wird gezeigt und es wurde festgestellt, dass sie in 27 der 72 GTDB-Variovorax-Genomen kodiert ist. Nur fünf der Genome kodieren einen vollständigen Pantothenat-Biosyntheseweg. Als Außengruppe wird Rhodoferax saidenbachensis dargestellt. Zweige, die durch Bootstrap-Werte größer als 75 unterstützt werden, werden als Kreise angezeigt. Der Bioreaktor Variovorax hat die größte Ähnlichkeit mit Variovorax sp003019815 (GCF_003019815.1). b Die GTDB-Genome von Gattungen innerhalb der Proteobacteria-Genomen in GTDB wurden auf die Kodierung vollständiger Thiamin-Biosynthesewege untersucht. Variovorax war eine der Gattungen mit dem größten Anteil an kodierter Thiamin-Biosynthese. c Die Anzahl der von den 309 im Bioreaktor gewonnenen Genomen kodierten Vitamine wurde über die Genomlänge hinweg bewertet. Boxplot-Whisker stellen die minimalen und maximalen Werte innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs dar, während die Grenzen der Box das 25. und 75. Perzentil angeben und die Mitte den Median angibt. Genome, die für die Biosynthese von 5–6 Vitaminen kodierten, waren statistisch gesehen größer als diejenigen, die weniger kodierten (T-Test mit zweiseitigen unabhängigen Stichproben, 0,01>p > 0,001. wobei n0–1 = 25, n2 = 19, n3 = 31, n4 = 32 und n5-6 = 13 biologisch unabhängige mikrobielle Genome). Kodierte Vitamine vs. kodierte Vitamine Nr. 2, p-Wert: 0-1 und 5-6 p = 0,0014; 2 und 5-6 p = 0,0063; 3 und 5-6 p = 0,0051; 4 und 5-6 p = 0,0044.

Von den 72 aus Isolaten und Metagenomen abgeleiteten Variovorax-Genomen in GTDB kodierten 27 einen nahezu vollständigen bis vollständigen Thiamin-Biosyntheseweg (37,5 %). Jedes dieser 27 Genome kodierte eine Thiazol-Synthase (thiG), 17 davon kodierten einen vollständigen Thiamin-Biosyntheseweg und die anderen 10 kodierten einen nahezu vollständigen Weg (Abb. 5), der durch das Vorhandensein von Genen in vier großen enzymatischen Schritten definiert wird (in der Methodik beschrieben). Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass nur fünf einen vollständigen Pantothenat-Biosyntheseweg kodieren.

Wir untersuchten unsere Bioreaktorgenome und stellten fest, dass diejenigen, die für fünf oder mehr der Vitamine und Cofaktoren Thiamin, Biotin, Tetrahydrofolat, Riboflavin, NAD und Pantothensäure kodieren, eine deutlich größere Genomgröße aufwiesen als diejenigen, die für weniger als fünf kodierten (Abb. 5c). .

Um die Hypothese zu testen, dass Variovorax als Thiaminlieferant für Thiamin-Auxotrophe fungieren kann, haben wir unsere Bioreaktor-Isolate auf Mikroorganismen untersucht, deren Wachstum durch den Einbau von Thiamin in Minimalmedien stark gesteigert wurde und die daher in einem Bioassay verwendet werden könnten. Dadurch wurde Hefeisolat der Gattung Cryptococcus als Thiamin-Auxotroph identifiziert (Abb. 6a). Wir stellten die Hypothese auf, dass der vorhergesagte Thiaminproduzent Variovorax bei der Co-Kultur in Minimalmedien dem Cryptococcus einen Fitnessvorteil verleihen würde. Tatsächlich erhöhte sich die Zelldichte von Cryptococcus in einer Co-Kultur um das etwa 90-fache (Abb. 6b). Auch Variovorax profitierte von dieser Wechselwirkung und stieg von 7 × 105 Zellen/ml in Reinkultur auf 9 × 108 Zellen/ml in Co-Kultur mit Cryptococcus (~130-fach).

a Ein aus der Bioreaktorgemeinschaft isolierter Kryptokokkus ist nachweislich ein Thiamin-Auxotropher, wobei seine optische Dichte (OD) in Minimalmedien nur durch die Zugabe von Thiamin zunimmt. b Die Zelldichte dieses Kryptokokkus im Steady-State erhöht sich um das ~50-fache, wenn er in Co-Kultur mit Variovorax in M9-Medien gezüchtet wird. Auch Variovorax erhält durch das Zusammenspiel einen Fitnessvorteil. c Variovorax produziert große Mengen extrazelluläres Thiamin in reiner Kultur in Minimalmedien, ergänzt mit 25 % verbrauchten Medien von Cryptococcus, die 5 Tage lang in Minimalmedien gezüchtet wurden. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung vom Mittelwert von n = 3 biologisch unabhängigen Experimenten dar.

Um zu bestätigen, dass Variovorax Thiamin produziert, haben wir das Vorhandensein von Thiamin während der Kultivierung von Variovorax in Minimalmedien unter Zugabe von 25 % verbrauchtem Medium aus einer fünftägigen Monokultur von Cryptococcus in Minimalmedium überwacht. In Minimalmedien ohne Zugabe verbrauchter Medien wurde kein sichtbares Wachstum von Variovorax beobachtet. Das verbrauchte Medium ermöglichte es Variovorax, nach 96 Stunden eine optische Dichte (OD600) von ~0,15 zu erreichen (Abb. 6c), allerdings auf nahezu lineare Weise. Die Thiaminkonzentration stieg gleichzeitig mit dem Variovorax-Wachstum von 3,6 mg/L zu Beginn des Experiments auf ein Maximum von 100 mg/L nach 96 Stunden.

Wir haben zuvor aufgrund seines Genoms vorhergesagt, dass Variovorax ein Pantothenat-Auxotroph ist, und dies in einer Reihe kurzer Wachstumsexperimente bestätigt (Ergänzungsdaten 3). Trotz des schlechten Wachstums des Cryptococcus in Minimalmedien über fünf Tage konnten wir etwa 5 mg/L Pantothenat in seinem verbrauchten Medium nachweisen, was darauf hindeutet, dass die Produktion von Pantothenat durch Cryptococcus für das verbesserte Wachstum von Varioovrax in der Co-Kultur verantwortlich sein könnte. Wir finden bei Variovorax Verbindungen zu zwei Pantothenat-Produzenten im Netzwerk (Abb. S5).

Wir führten Wachstumsexperimente mit Variovorax in Minimalmedien in Gegenwart steigender Pantothenatkonzentrationen durch (Abb. 7). In allen Fällen wurde zunächst ein langsames lineares Wachstum beobachtet, gefolgt von einem exponentiellen Wachstum nach einer längeren Verzögerungsphase (Abb. 7a). Steigende Pantothenatkonzentrationen ermöglichten das Erreichen größerer optischer Dichten bis zum Einsetzen dieser Verzögerungsphase. Anschließend verlief die extrazelluläre Thiaminproduktion linear (Abb. 7b), bis ein exponentielles Wachstum einsetzte, woraufhin das produzierte Thiamin schnell verbraucht wurde. Höhere Konzentrationen des zugeführten Pantothenats korrespondierten mit höheren produzierten Thiaminkonzentrationen, wobei in den mit 5 mg/L Pantothenat ergänzten Kulturen ein Maximum von 39,5 mg/L Thiamin beobachtet wurde. Die höheren Pantothenatkonzentrationen ermöglichten auch, dass ein exponentielles Wachstum früher nach der Inokulation erreicht wurde. Die spezifische Thiaminproduktionsrate (pro Einheit der optischen Dichte produziertes Thiamin) war jedoch zwischen den zugeführten Pantothenatbedingungen weitgehend konsistent. Interessanterweise zeigte Variovorax in den ersten 144 Stunden ohne zugeführtes Pantothenat nur ein sehr geringes Wachstum, produzierte jedoch in den ersten 144 Stunden immer noch beträchtliche Mengen an extrazellulärem Thiamin (8,4 mg/l).

Wachstum, gemessen anhand der optischen Dichte (OD), von Variovorax (a) und seiner Thiaminproduktion (b), wenn es in M9-Minimalmedium unter Zusatz unterschiedlicher Konzentrationen an Pantothenat (Vitamin B5) gezüchtet wird. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung vom Mittelwert von n = 4 biologisch unabhängigen Experimenten dar.

Hier haben wir durch die Überlagerung funktioneller Metagenominformationen mit Koexistenznetzwerken mehrere Mikroorganismen in einer komplexen mikrobiellen Gemeinschaft identifiziert, von denen wir annehmen, dass sie für die Bereitstellung von B-Vitaminen wichtig sind. Wir haben eine Hubness-Metrik entwickelt, mit der bewertet werden kann, inwieweit eine Ressource von Interesse für die Strukturierung mikrobieller Interaktionen innerhalb von Subnetzwerken von Netzwerken wichtig ist, die Muster des gleichzeitigen Vorkommens mikrobieller Gemeinschaften beschreiben (Abb. 2c). Wir haben diesen Ansatz zur Berechnung der Thiamin-Hubness-Metrik verwendet und vorhergesagt, dass ein Variovorax sp. ist ein Knotenpunkt (Abb. 2a), da er andere Organismen in seiner unmittelbaren Netzwerkumgebung mit Thiamin versorgt. Die Metrik berücksichtigt die Anzahl der Verbindungen zwischen einem Hub-Organismus (wie Variovorax) und anderen Organismen in seiner unmittelbaren Netzwerknachbarschaft, die Anzahl der Thiamin-Autotrophen in diesem Nachbarschaftssatz, berücksichtigt aber auch die Anzahl der Verbindungen zwischen diesen Thiamin-Auxotrophen und dem vorhergesagten Thiamin anderen Herstellern als Variovorax. Dieser letzte Begriff spielt die Bedeutung einer vorhergesagten Interaktion in Fällen herunter, in denen andere Organismen (innerhalb der unmittelbaren Netzwerkumgebung oder außerhalb davon) alternative Quellen der Ressource sein könnten. Diese Metrik kann problemlos auf zukünftige Analysen angewendet werden, um Auxotrophien und Stoffwechselaustausch in anderen mikrobiellen Gemeinschaften zu bewerten. In zukünftigen Arbeiten wäre es interessant zu untersuchen, wie höhere Konzentrationen an Melasse, anderen komplexen Substraten oder Vitaminzusätzen das Netzwerk neu konfigurieren würden.

Wir haben den Netzwerk-Hub-Organismus Variovorax isoliert, von dem wir vorhersagten, dass er wichtig für die Biosynthese von Thiamin ist. Thiamin ist ein Cofaktor, der von Enzymen im gesamten Zentralstoffwechsel benötigt wird, einschließlich denen des Tricarbonsäurezyklus25, des Pentosephosphatwegs26 sowie des Aminosäurekatabolismus und -anabolismus27. Es wird jedoch nicht davon ausgegangen, dass alle Bakterien in den Bioreaktorgemeinschaften die für die Thiaminsynthese erforderlichen Gene kodieren. Im Gegensatz zu den meisten früheren Studien, in denen Genomdaten zur Untersuchung möglicher mikrobieller gegenseitiger Abhängigkeiten verwendet wurden, haben wir die Vorhersage experimentell getestet und die Thiaminproduktion und die gegenseitige Abhängigkeit korrekt vorhergesagt. Wir bestätigten den Vitaminaustausch durch Isolierung und Charakterisierung des Variovorax, der vermutlich für die Thiaminproduktion verantwortlich ist, zusammen mit einem isolierten Thiamin-Auxotrophen, Cryptococcus. Wir berichten über Hinweise darauf, dass Cryptococcus ein Pantothensäureproduzent ist, ein B-Vitamin, für das Variovorax auxotrophe Wirkung hat. Diese Komplementarität führte zu einer 90- bis 130-fachen Erhöhung der Zelldichte beider Mitglieder, wenn sie in Co-Kultur gezüchtet wurden. Cryptococcus war im Korrelationsnetzwerk nicht vorhanden, wahrscheinlich weil es nur in einer Handvoll Gemeinden vorkam. Obwohl es möglich ist, dass diese beiden Organismen in den gemischten Bioreaktorgemeinschaften nicht direkt miteinander interagieren, zeigen der Austausch von Vitaminen zwischen ihnen in der Co-Kultur und die daraus resultierenden Fitnesseffekte, dass der Vitaminaustausch wahrscheinlich einen starken Einfluss auf Variovorax und hat Thiamin-Auxotrophe in den Bioreaktorgemeinschaften.

Wir stellten eine Korrelation zwischen Variovorax und zwei Saccharibakterien fest, einem Kapabacteria, einem Chloroflexi und einem Arminatododetes sp. (Abb. 4). Es wird vorhergesagt, dass der vorhergesagte Mikrobakterium-Wirt eines der Saccharibakterien ebenfalls ein Thiamin-Auxotropher ist. Diese Ergebnisse legen die wichtige Möglichkeit nahe, dass die allgemein vorhergesagte Abhängigkeit von Saccharibakterien von einer Actinobakterienart28,29,30,31 komplexer sein kann und in diesem Fall einen dritten Organismus betrifft, der zur Vitaminproduktion fähig ist (Variovorax, der Thiamin liefert). Die deutlich größere Genomgröße von Genomen wie Variovorax, die für mehr Vitamin-Biosynthesewege kodieren, lässt auf einen Kompromiss zwischen Genom-Straffung und Vitamin-Auxotrophen schließen, wie kürzlich von Rodríguez-Gijón et al.32 festgestellt wurde. Dies könnte eine wichtige Beobachtung für die Identifizierung wichtiger Vitaminlieferanten in mikrobiellen Gemeinschaften sein.

Variovorax hat sich als wichtiges Mitglied mikrobieller Gemeinschaften in der Rhizosphäre erwiesen33. Zuvor berichtete Variovorax-Genome kodieren für ein Repertoire komplexer Gene, die Kohlenstoffverbindungen abbauen, was mit dem genetischen Potenzial unseres Variovorax übereinstimmt (Abb. 3). Es wurde experimentell gezeigt, dass Mitglieder dieser Gattung komplexe Kohlenstoffverbindungen wie Herbizide34 und pflanzenproduzierte Isoprene35 abbauen, deren Abbauprodukte andere mikrobielle Mitglieder unterstützen, die diese Verbindungen nicht direkt verbrauchen können. Unsere Ergebnisse sind die ersten, die zeigen, dass Variovorax mikrobielle Gemeinschaften durch die Bereitstellung eines Vitamins unterstützt. Wir fanden heraus, dass das Thiamin-Biosynthese-Operon in vielen Mitgliedern der Gattung Variovorax vorhanden ist (Abb. 5), und daher könnte die Thiaminproduktion zusätzlich zu ihren zahlreichen anderen, bereits aufgeklärten Rollen eine gemeinsame Funktion sein.

Variovorax ist an Symbiosen beteiligt, an denen sowohl Pflanzen als auch Bakterien beteiligt sind. Finkel et al.33 fanden heraus, dass Variovorax das einzige Mitglied eines 185-köpfigen Syncoms war, das für den Abbau des von Bakterien produzierten Auxins verantwortlich ist, das, wenn es nicht metabolisiert wird, zur Hemmung des Wurzelwachstums bei Arabidopsis-Sämlingen führt. Variovorax wurde auch häufig als guter Pflanzenendosymbiont bezeichnet36. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass ein endophytisches Herbaspirrilum ein Serobactin-Siderophor produziert, das in unserem Variovorax-Genom vorkommt, und es wurde gezeigt, dass es unter eisenlimitierenden Bedingungen direkt zur Pflanzengesundheit beiträgt37. Diese und andere Merkmale unterstützen das Potenzial von Variovorax als landwirtschaftliches Probiotikum38,39.

Wir haben gezeigt, dass Variovorax nicht nur das Wachstum eines Thiamin-auxotrophen Mikroorganismus unterstützen kann, sondern auch extrazelluläre Thiaminkonzentrationen von bis zu 100 mg/L erzeugen kann. Bakterien benötigen typischerweise nur 0,1–10 ng/ml für optimales Wachstum40,41 und natürliche und die meisten manipulierten Überproduzenten produzieren typischerweise nur 1–2 mg/L extrazelluläres Thiamin23,42,43. Für biotechnologische Anwendungen wurden jedoch Thiamin-deregulierende Mutanten entwickelt23,44, die bis zu 300 mg/L Thiamin produzieren können. Diese Mutationen beinhalten die Deletion der Thiamin-Monophosphat-Kinase (thiL), die für die Phosphorylierung von Thiamin-Phosphat verantwortlich ist, einer Thiamin-Permease (yuaJ) und eines aktiven Transporters, der speziell für den Thiamin-Einstrom verantwortlich ist (ykoD). Die Analyse der isolierten Variovorax-Thiamin-Monophosphat-Kinase (thiL)-Proteinsequenz scheint funktionsfähig zu sein, basierend auf einem Vergleich mit der Kristallstruktur und der Sequenzanalyse von McCulloch et al.24. Die Reste des aktiven Zentrums unseres thiL von Variovorax scheinen konserviert zu sein und die zusätzlichen konservierten Reste, die von McCulloch und Co-Autoren identifiziert wurden, wurden weitgehend beibehalten. Dies unterstützt, dass die Regulierung dieses Operons funktionsfähig ist. Wir vermuten, dass Variovorax sich so entwickelt hat, dass es große Mengen Thiamin produziert, um abhängige Organismen zu unterstützen, von denen einige wiederum Pantothenat produzieren. Es ist wahrscheinlich, dass Betrüger, also Organismen, die Thiamin konsumieren, aber im Gegenzug nichts Nützliches für Variovorax produzieren, diesen Thiamin-produzierenden Phänotyp ausnutzen. Die Überwindung von Betrügern könnte erklären, warum Variovorax so hohe Thiaminkonzentrationen produziert.

Das Wachstum von Variovorax in Minimalmedien konnte durch die Zugabe von Pantothenat stimuliert werden. Die Ergänzung höherer Pantothenatkonzentrationen führte zu einer kürzeren Dauer der Lag-Phase mit höheren unterstützten Zelldichten. Während dieser Verzögerungsphase wurde dann eine Überproduktion von Thiamin beobachtet. Der beobachtete Wechsel von der Thiaminproduktion zum Verbrauch durch Variovorax zu Beginn des exponentiellen Wachstums bestätigt, dass das Thiamin-Biosyntheseoperon ordnungsgemäß reguliert werden kann und nicht konstitutiv aktiviert ist, wie dies bei fehlregulierten Mutanten der Fall ist44. Wir nehmen an, dass sich in diesem Variovorax die Produktion hoher Thiaminkonzentrationen während der Lag-Phase entwickelt haben könnte, um das Wachstum von hauptsächlich Pantothenat produzierenden Bakterien zu stimulieren. Variovorax steht in Zusammenhang mit zwei Pantothenat-Produzenten. Obwohl Crypotoccus nicht häufig genug vorkam, um in das Netzwerk aufgenommen zu werden, ist es wahrscheinlich ein Beispiel für diese gegenseitige Abhängigkeit. Der extreme Thiamin-produzierende Phänotyp und die Prävalenz dieses Operons in der Gattung Variovorax legen das Potenzial von Variovorax für die biotechnologische Vitaminproduktion nahe.

Aktuelle Studien, die mikrobielle Gemeinschaften mit etablierten mikrobiellen Interaktionen simulieren, haben gezeigt, dass die Ableitung mikrobieller Interaktionen aus Korrelationen fehlerhaft sein kann, insbesondere wenn Korrelationen aus verrauschten Daten abgeleitet werden45. Der Einsatz von Bioreaktoren zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften ermöglicht die Aufrechterhaltung vieler Bedingungen, wie z. B. Temperatur, Verdünnungsrate und Konzentrationen ankommender gelöster Stoffe. Die stationären Bedingungen, die in kontinuierlichen Rührkesselreaktoren schnell erreicht werden, führen zu stabilen mikrobiellen Gemeinschaften, reduzieren wahrscheinlich den Lärm und haben möglicherweise eine robustere Schlussfolgerung der mikrobiellen Interaktion aus unserer Netzwerkanalyse ermöglicht. Unsere Integration der Netzwerkanalyse mit der Signalwegrekonstruktion aus der genomaufgelösten Metagenomik stellt ein leicht umsetzbares Werkzeug zur Identifizierung interagierender Mitglieder der mikrobiellen Gemeinschaft und ihrer Interaktionsmechanismen dar. Der Ansatz verdeutlicht den Wert metagenomischer Datensätze aus Probenserien und lässt sich problemlos in zukünftige Studien anderer mikrobieller Konsortien umsetzen.

Zusammenfassend demonstrieren wir anhand von Experimenten in Laborkonsortien und Co-Kulturen isolierter Mikroorganismen die Vorhersagekraft kombinierter Netzwerkanalysen, genomaufgelöster Metagenomik und Signalwegrekonstruktion zur Aufklärung von Interaktionen in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Wir liefern Belege für gegenseitige Abhängigkeiten, beispielsweise zwischen Arten symbiotischer Saccharibakterien, Actinobakterien und Variovorax, sowie für den Vitaminaustausch, beispielsweise zwischen Variovorax und Cryptococcus. Unsere Ergebnisse gehen davon aus, dass sich Variovorax in unserem Konsortium so entwickelt hat, dass es Thiamin überproduziert, um Organismen zu unterstützen, die für dieses Vitamin darauf angewiesen sind, und liefern Hinweise darauf, dass die Thiaminproduktion in vielen Ökosystemen wahrscheinlich ein wichtiges Merkmal dieser Bakterien ist.

Die zur Untersuchung dieses mikrobiellen Konsortiums verwendeten Bioreaktoren wurden von Kantor et al.9, Kantor et al.10, Rahman et al.11 und Huddy et al.12 betrieben und Proben entnommen. Kurz gesagt wurden 1-Liter-Rührtankreaktoren aus Glas mit homogenisierten Biofilm- und Planktonproben geimpft, die aus langlebigen Thiocyanat-abbauenden Bioreaktoren an der Universität von Kapstadt entnommen wurden. Die Reaktoren wurden unter Verwendung eines Schrägschaufelrührwerks bei 270 U/min gerührt und mit gefilterter Luft mit 0,9 l/min besprüht. Die Bioreaktoren wurden kontinuierlich mit entionisiertem Wasser mit 0,28 mM KH2PO4 gespeist und mit 5 N KOH auf pH 7,0 gepuffert. Als vorherrschender Elektronendonor wurden dem Medium variable Konzentrationen von Natriumthiocyanat (50–2000 mg/l) zugeführt. In einigen Bioreaktormedien war Melasse in einer Menge von 0,15 g/L enthalten, während in anderen darauf verzichtet wurde. Alle Bioreaktoren wurden kontinuierlich mit hydraulischen Verweilzeiten zwischen 12 und 42 Stunden betrieben. Biofilm- und Planktonproben wurden aus den Bioreaktoren im chemischen Gleichgewichtszustand gewonnen, wie in den oben genannten Studien beschrieben.

Zuvor veröffentlichte MAGs9,10,11,12, die aus 92 Thiocyanat-Bioreaktor-Metagenomen gewonnen und rekonstruiert wurden, wurden gepoolt und ein endgültiger Genomsatz wurde mit dRep (v3.0.0, https://github.com/MrOlm/drep)46 bei 95 % ANI erstellt . Offene Leserahmen (ORFs) wurden mit Prodigal v2.6.347,48 vorhergesagt und mit Hmmscan (http://hmmer.org/) anhand der Datenbanken KEGG (Release 2022/04) und PFAM v35.0 annotiert. Vitaminwege wurden von der KEGG-Website und der einschlägigen Literatur ermittelt49. Die Fähigkeit, ein Vitamin zu produzieren, wurde anhand eines Mindestsatzes an Genen bestimmt, die verschiedene Stufen jedes Stoffwechselwegs repräsentieren. Diese für das angenommene Vorhandensein eines Signalwegs erforderlichen Mindestgene sind in den Zusatzdaten 5 beschrieben.

Die Lesevorgänge wurden dem dereplizierten Genomsatz zugeordnet und die relative Häufigkeit mithilfe von CoverM berechnet (coverm genome -m relative Häufigkeit, https://github.com/wwood/CoverM). Coverm berechnet die relative Häufigkeit eines Genoms, indem es die Anzahl der Lesebasen, die mit dem Genom übereinstimmen, durch seine Gesamtlänge dividiert. Dieser Wert wird dann mit dem Anteil der gesamten Lesevorgänge multipliziert, die dem Genom zugeordnet sind. Korrelationen und zugehörige p-Werte zwischen den relativen Häufigkeitswerten der Genomen wurden mit FastSpar17 (https://github.com/scwatts/fastspar) berechnet, das den SparCC-Algorithmus18 implementiert, und wiederum separat mit Flashweave19 (sensitiv=true, heterogeneous=true). , Alpha=0,05, max_k = 0, https://github.com/meringlab/FlashWeave.jl).

Die Netzwerkanalyse wurde mit Korrelationen größer oder gleich 0,35 durchgeführt. Es wurden keine negativen Korrelationen berücksichtigt. Die Netzwerkanalyse wurde mit NetworkX50 durchgeführt und zur Berechnung der Betweenness-Zentralität (Gleichung 1) für jeden Knoten und der gesamten Netzwerkdichte (Gleichung 2) verwendet.

Dabei ist σ (s, t) die Gesamtzahl der kürzesten Pfade zwischen den Knoten s und t und σ (s, t | v)) die Anzahl der Pfade, die durch den Knoten v verlaufen.

Dabei ist m gleich der Anzahl der Kanten und n gleich der Anzahl der Knoten.

In dieser Studie wurde eine dritte Metrik zur Quantifizierung der Bedeutung eines Vitaminproduzenten innerhalb des Netzwerks entwickelt (Gleichung 3), die als Vitamin-Hub-Metrik bezeichnet wird.

Dabei ist h die Vitamin-Hub-Metrik für Knoten v, Dtotal die Gesamtzahl der Kanten von Knoten v, Dauxotroph die Anzahl der Kanten vom Knoten v zu Vitamin-Auxotrophen, N die Gesamtzahl dieser auxotrophen Knoten und Σ (Dauxotroph, Dproducer) bezieht sich auf die Summe der Kanten, die diese auxotrophen Knoten mit Knoten teilen, die in der Lage sind, das Vitamin zu produzieren.

Diese Metrik wird berechnet, indem der Grad eines Knotens mit der Fähigkeit, ein bestimmtes Vitamin zu synthetisieren, mit der Anzahl der Kanten multipliziert wird, die er mit Knoten teilt, von denen vorhergesagt wird, dass sie für das gegebene Vitamin auxotroph sind. Dieses Produkt wird durch die mittlere Anzahl gemeinsamer Kanten zwischen jedem der auxotrophen Nachbarn des Knotens und den Knoten geteilt, von denen vorhergesagt wird, dass sie das Vitamin synthetisieren. Netzwerke wurden mit Cytoscape v3.8.2 (http://www.cytoscape.org/) visualisiert. Netzwerkmodule wurden mit der von Networkx50 implementierten Louvain-Methode bestimmt. Die Modulerkennung wurde mit dem Girvan-Newman-Algorithmus wiederholt (Abb. S2) und ergab sehr ähnliche Module, die daher in den Ergebnissen nicht aufgeführt wurden.

Alle Vergleiche von Mittelwerten und Varianzen wurden unter Verwendung eines zweiseitigen t-Tests für unabhängige Stichproben unter der Annahme einer ungleichen Varianz durchgeführt, der in Python unter Verwendung des Moduls scipy.stats aus der SciPy-Bibliothek implementiert wurde.

Artenvertreter in GTDB51 (r207_v2; https://gtdb.ecogenomic.org/searches?s=al&q=Variovorax) wurden wie oben beschrieben mit KEGG-HMMs annotiert und ihre Fähigkeit zur Thiaminsynthese bewertet. Als Variovorax klassifizierte Genome wurden dann mithilfe von dRep46 mit einer durchschnittlichen Nukleotididentität von 98 % (~Unterartenebene) derepliziert. GToTree v1.5.3152 wurde verwendet, um 16 universelle ribosomale Proteine ​​aus den Variovorax-Genomen zu identifizieren, auszurichten, zu trimmen und zu verketten. Eine phylogenetische Maximum-Likelihood-Rekonstruktion dieser Alignments wurde unter Verwendung von IQtree53 (-st AA -nt 48 -bb 1000 -m LG + G4 + FO + I) durchgeführt. Der phylogenetische Baum wurde dann in iTol54 v6.5.8 mit Anmerkungen versehen. Die Kontamination dieser Genome wurde mit CheckM v1.2.155 geschätzt. Vollständige Thiamin-Biosynthesewege enthielten alle KEGG-Anmerkungen für (i) Thiazolproduktion, (ii) Pyrimidinsynthese, (iii) die Verknüpfung dieser beiden Einheiten und (iv) die am gesamten Biosyntheseprozess beteiligten Kinasen. Nahezu vollständige Wege waren diejenigen, denen in diesem Weg nur eine Phosphomethylpyrimidin-Synthase (thiC, K03147) fehlte.

Mikrobielle Isolate wurden aus einem hauseigenen Thiocyanat-abbauenden Bioreaktor durch serielle Verdünnung in sterilem 1x PBS-Puffer und Ausplattieren auf R2A-Festagarmedium gewonnen. Die gewonnenen Isolate wurden in flüssigem R2A-Medium gezüchtet und 600 μl 1:1 mit 50 % (v/v) Glycerin kombiniert, bevor sie bei –80 °C gelagert wurden. Die verbleibende Zellkultur wurde 10 Minuten lang bei 10.000 g pelletiert und für die anschließende DNA-Extraktion verwendet. Die Gesamt-DNA wurde aus den Isolaten mit einem DNAeasy® PowerSoil® Pro DNA-Extraktionskit (Machery-Nagel, Deutschland) extrahiert. Paired-End-Illumina-TruSeq-Bibliotheken mit Fragmentgrößen von 500 bp wurden auf einem Illumina NovaSeq sequenziert, um 250-bp-Paired-End-Reads zu ergeben. Die Lesevorgänge wurden mit Sickle (www.github.com/najoshi/sickle) getrimmt und mit IDBA-UD56 unter Verwendung der Standardeinstellungen zusammengestellt. Die Annotation wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Genomassemblierungen wurden mithilfe von ggKbase (https://ggkbase.berkeley.edu) manuell auf Kontamination und Vollständigkeit überprüft, basierend auf der GC, der Abdeckung und Phylogenie von Gerüsten und dem Vorhandensein bakterieller Einzelkopie-Markergene.

Die gewonnenen Isolate wurden unter Verwendung fester M9-Minimalmedien (0,4 g/L Glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM NaCl, 0,048 mM Na2HPO4,7H2O, 0,022 mM KH2PO4, 0,017 mM NaCl, 15 g/L Agar) auf Thiamin-Auxotrophen untersucht und ohne Zusatz von 0,5 mg/L Thiamin. Die als mögliche Thiamin-Auxotrophe identifizierte Cryptococcus-Spezies wurde in einer 96-Well-Platte in flüssigem M9-Minimalmedium mit (n = 6) und ohne (n = 6) Zusatz von 0,5 mg/L Thiamin gezüchtet. Das Wachstum wurde spektrophotometrisch bei 600 nm quantifiziert.

Um die Wirkung des Wachstums von Variovorax auf Cryptococcus und umgekehrt zu bewerten, wurde jedes dieser Isolate in Reinkultur und in Co-Kultur in Minimalmedien gezüchtet. Zunächst wurden die Isolate über Nacht in R2A-Medium gezüchtet, 3 Minuten lang bei 3000 g zentrifugiert und in M9-Minimalmedium gewaschen, bevor sie jeweils mit 10 ml M9-Minimalmedium bei einer anfänglichen OD600 von 0,035 inokuliert wurden. Man ließ die Rein- und Co-Kulturen 48 Stunden lang wachsen, bevor sie in frisches M9-Medium überführt wurden, und dies wurde für insgesamt 4 Passagen wiederholt. Unmittelbar nach jeder Passage wurden die Dichten lebensfähiger Zellen durch serielle Verdünnung in M9-Medium und Ausplattieren auf R2A-Medium-Agar bestimmt. Diese Platten wurden 48 Stunden lang bei 30 °C inkubiert und die Kolonien wurden gezählt und anhand der Koloniemorphologie (Cryptococcus weiß, Variovorax gelb) differenziert. Bei diesen Experimenten wurden nur biologische und keine technischen Wiederholungen durchgeführt.

Variovorax wurde in M9-Minimalmedium in Gegenwart unterschiedlicher Pantothenatkonzentrationen unter Verwendung der oben beschriebenen Methodik kultiviert, ließ es jedoch insgesamt 9 Tage lang wachsen. Die Kulturen wurden mit vier Replikaten durchgeführt und alle 24 Stunden aseptisch beprobt und hinsichtlich der optischen Dichte der Zellen quantifiziert. Anschließend wurden die Zellen 3 Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 10.000 g pelletiert und unter Verwendung eines 0,22-µm-Filters filtersterilisiert. Diese Lösungen wurden dann zur Quantifizierung von extrazellulärem Thiamin verwendet.

Die Menge des von Variovorax produzierten Thiamins wurde während des Wachstums in 75 % frischem Minimalmedium und 25 % filtersterilisiertem verbrauchtem Medium aus der letzten Passage des Co-Kultur-Experiments sowie während des Wachstums von Variovorax in M9-Minimalmedium mit variierenden Mengen quantifiziert Konzentrationen von Pantothenat. Thiamin wurde auf einem Agilent 1200-Flüssigkeitschromatographen quantifiziert, der mit einer Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18-Säule mit einer Partikelgröße von 5 µm ausgestattet war und bei 35 °C gehalten wurde. Unter Verwendung einer zweiphasigen mobilen Phase aus (A) 25 mM NaH2PO4 (pH = 2,5) und (B) reinem Methanol. Die Flussrate betrug 1,0 ml/min. Die Mischung dieser mobilen Phasen war wie folgt: 0 % mobile Phase B ab dem Zeitpunkt der Injektion, 50 % mobile Phase B von 1,0 Min. bis 75 % mobile Phase B von 10 bis 25 Min. Wir haben Vitamine mit einem G1362A-Brechungsindexdetektor bei 220 nm identifiziert. Vitaminstandards wurden von Sigma-Aldrich® bezogen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Variovorax- und Proteobakteriengenome, die auf Vollständigkeit des Signalwegs untersucht wurden, wurden aus GTDB (r207_v2, https://gtdb.ecogenomic.org/) gewonnen. Die in dieser Studie verwendeten 309 dereplizierten Bioreaktorgenome sind über die Online-Datenbank ggKbase unter https://ggkbase.berkeley.edu/SCN_92/organisms verfügbar. Die Rohdaten und alle MAGs aus früheren Studien, die in dieser Studie verwendet wurden, sind bei NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) unter den Zugangscodes PRJEB29350 (https://www.ncbi.nlm) verfügbar .nih.gov/bioproject/513540), PRJNA279279 und PRJNA629336. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Benutzerdefinierter Code zur Durchführung von Netzwerkanalysen und zur Berechnung von Vitamin-Hub-Metriken (doi: 10.5281/zenodo.8122228) finden Sie unter https://github.com/tomas-hesler/Vitamin_interdependencies_2023/.

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Dieses Material von m-CAFEs Microbial Community Analysis and Functional Evaluation in Soils, ([email protected]), einem wissenschaftlichen Schwerpunktbereich unter der Leitung des Lawrence Berkeley National Laboratory, basiert auf Arbeiten, die vom US-Energieministerium, Office of Science, unterstützt werden. Büro für Biologische und Umweltforschung unter der Vertragsnummer DE-AC02-05CH11231. Wir möchten Dr. Christine He, Dr. Sumayah Rahman und Dr. Rose Kantor für die Probenentnahme und die Verarbeitung metagenomischer Sequenzierungsdaten danken. Wir danken Yi Liu für die Unterstützung bei der HPLC, Dr. Maria Lukarska für die Unterstützung bei diesem Sequenzvergleich und Prof. Michi Taga für wertvolle Diskussionen.

Das Innovative Genomics Institute an der University of California, Berkeley, CA, USA

Tomas Hessler, Rohan Sachdeva, Spencer Diamond und Jillian F. Banfield

Das Department of Earth and Planetary Science, University of California, Berkeley, CA, USA

Tomas Hessler, Rohan Sachdeva, Shufei Lei, Spencer Diamond und Jillian F. Banfield

Abteilung für Umweltgenomik und Systembiologie, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA

Tomas Hessler

Forschungsbüro, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Universität Kapstadt, Kapstadt, Südafrika

Robert J. Huddy

Das Zentrum für bioprozesstechnische Forschung, Universität Kapstadt, Kapstadt, Südafrika

Susan TL Harrison

Das Future Water Institute, Universität Kapstadt, Kapstadt, Südafrika

Susan TL Harrison

Fakultät für Chemieingenieurwesen, Universität Kapstadt, Kapstadt, Südafrika

Susan TL Harrison

Das Department of Environmental Science, Policy and Management, University of California, Berkeley, CA, USA

Jillian F. Banfield

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TH, SD und JFB konzipierten die Studie und gestalteten die Experimente. TH führte eine Informationsanalyse durch und führte die Experimente durch. TH und JFB haben das erste Manuskript geschrieben. RJH, SL, RS und STLH steuerten wichtige Ressourcen und Ratschläge bei. Alle Autoren haben zum Manuskript beigetragen.

Korrespondenz mit Jillian F. Banfield.

JFB ist Mitbegründer von Metagenomi. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Silvio Waschina und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hessler, T., Huddy, RJ, Sachdeva, R. et al. Durch metagenomisch fundierte Netzwerkanalysen vorhergesagte und in mikrobiellen Gemeinschaftsmikrokosmen validierte Vitamin-Interdependenzen. Nat Commun 14, 4768 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40360-4

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Eingegangen: 15. Februar 2023

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40360-4

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